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Jun 29, 2023

Entropische Abstoßung von Cholesterin

Nature Band 618, Seiten 733–739 (2023)Diesen Artikel zitieren 12.000 Zugriffe 75 Details zu altmetrischen Metriken Die Kontrolle der Adhäsion ist ein auffälliges Merkmal lebender Materie, das von besonderem Interesse ist

Nature Band 618, Seiten 733–739 (2023)Diesen Artikel zitieren

12.000 Zugriffe

75 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Kontrolle der Adhäsion ist ein auffälliges Merkmal lebender Materie, das im Hinblick auf die technologische Übersetzung von besonderem Interesse ist1,2,3. Wir haben herausgefunden, dass die durch Orientierungsschwankungen der Cholesterinschichten an der Grenzfläche verursachte entropische Abstoßung die Proteinadsorption und die Bakterienadhäsion einschränkt. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass intrinsisch haftende Wachsesterschichten ähnlich antibioadhäsiv werden, wenn sie geringe Mengen (unter 10 Gew.-%) Cholesterin enthalten. Benetzungs-, Adsorptions- und Adhäsionsexperimente sowie atomistische Simulationen zeigten, dass die Abstoßungseigenschaften von der spezifischen Molekülstruktur des Cholesterins abhängen, die eine fein ausgewogene, schwankende Neuorientierung an der Grenzfläche uneingeschränkter supramolekularer Anordnungen kodiert: Schichten von Cholesterinanaloga, die sich nur in winzigen molekularen Variationen unterscheiden zeigten eine deutlich unterschiedliche Grenzflächenmobilität und keine antiadhäsiven Wirkungen. Auch orientierungsfixierte Cholesterinschichten widersetzten sich der Bioadhäsion nicht. Unsere Erkenntnisse bieten eine konzeptionell neue physikochemische Perspektive auf Biogrenzflächen und können zukünftiges Materialdesign bei der Regulierung der Adhäsion leiten.

Das Leben hat eine Fülle wirksamer Prinzipien zur Kontrolle der Adhäsion entwickelt, von denen einige in technischen Materialien zusammengefasst wurden. Prominente Beispiele sind die superhydrophoben Blätter der heiligen Lotusblume1 und die omniphoben Oberflächen der Kannenpflanzen der Nepenthes-Pflanze2. Während Grenzflächenphänomene in der Natur umfassend untersucht werden, sind die physikalischen Mechanismen, die der Kontrolle der Bioadhäsion – der Grenzflächenakkumulation von Biopolymeren und Zellen (einschließlich Bakterien) – zugrunde liegen, noch nicht vollständig verstanden. Wir haben zuvor die omniphobe, antibioadhäsive Cuticula von Collembola untersucht (Abb. 1a) und festgestellt, dass sie aus nanoskopischen Strukturen mit überhängenden Querschnittsprofilen besteht (Abb. 1b, c), die eine Benetzung und Bakterienbesiedelung verhindern3,4,5,6. Später wurde gezeigt, dass die lipidreiche Hülle der Collembola cuticula (Abb. 1c), die als weitere „Verteidigungslinie“ gegen Bioadhäsion dient, aliphatische Kohlenwasserstoffe, insbesondere Steroide, Fettsäuren und Wachsester, enthielt (Abb. 1d und). Erweiterte Daten Abb. 1)7. Während davon ausgegangen werden kann, dass Wachsester die nicht benetzenden Eigenschaften der Cuticula unterstützen8, bleibt die Rolle von Steroiden und Fettsäuren ungeklärt. Es wurde berichtet, dass freie Fettsäuren Bakterien und Pilze abtöten oder deren Wachstum hemmen9,10, und es wurde festgestellt, dass Steroide die Bioadhäsion auf Schwämmen und Seesternen verringern11; Es gibt jedoch keine mechanistische Erklärung für diese Wirkung von Steroiden. Amphiphile Lipidkomponenten der Collembola cuticula sind auch in den Membranen tierischer und bakterieller Zellen enthalten und spielen eine Schlüsselrolle bei der Kompartimentierung und der funktionellen Ausrichtung molekularer Maschinen12. Insbesondere Cholesterin wurde umfassend untersucht und seine Anwesenheit gilt als entscheidend für die Regulierung funktioneller Lipiddomänen und die Interaktion zwischen Proteinen und Lipiden13. Allerdings ist die funktionelle Relevanz von Cholesterin an Grenzflächen lebender Strukturen außer Zellmembranen noch wenig erforscht.

a, Bild von Tetrodontophora bielanensis, einer beispielhaften Collembola sp. Maßstabsleiste, 1 mm. b, Rasterelektronenmikroskopisches Bild einer Cuticula von T. bielanensis. Maßstabsbalken, 500 nm. c, Querschnittsschema der Cuticula, das eine Schichtstruktur zeigt, die aus einem chitinreichen Innenskelett besteht, das von einer proteinreichen Schicht bedeckt ist. Eine dünne, lipidreiche Hülle bedeckt die proteinreiche Schicht. Maßstabsbalken, 200 nm. d, Zusammenfassung der in der äußeren Kutikulaschicht von T. bielanensis nachgewiesenen Lipide7. e, Schichten kutikulärer Collembola-Lipide; Cholesterinhaltige SCLs erleichtern die Orientierungsanpassung der obersten Lipide an die Polarität der Umgebung. ATR-FTIR-Messungen (ergänzende Abbildung 2) und dynamische Kontaktwinkelmessungen (Abbildung 2c und erweiterte Daten, Abbildung 4a) weisen auf hochgeordnete Cholesterinmoleküle hin, wobei der Kohlenwasserstoffschwanz der äußeren Cholesterinschicht zunächst zur Grenzfläche und die Hydroxylgruppen ausgerichtet sind innere. Über Thiolgruppen an Gold chemisorbierte SAMs, wobei entweder die polare oder die unpolare Seite des Cholesterins zur Grenzfläche orientiert war, dienten in ausgewählten Experimenten als Referenzen. f–i, Adsorbierte Proteinmenge (f,i) und normalisierte adhärente Zellen (g,h). Adsorbierte Proteinmenge (Lysozym oder fötales Rinderserum) auf einkomponentigen Schichten kutikulärer Collembola-Lipide (f) und mehrkomponentigen SCLs aus Stearylpalmitat und Cholesterin (i), bestimmt durch Quarzkristall-Mikrowaagenmessungen. Normalisierte adhärente Zellen von S. epidermidis auf einkomponentigen Schichten kutikulärer Collembola-Lipide (g) und mehrkomponentigen SCLs aus Stearylpalmitat und Cholesterin (h). Daten normalisiert auf die durchschnittliche adhärente Zelldichte auf einem Silica-Substrat (SiO2). h,i, Reine Stearylpalmitat-SCLs (100/0) und reine Cholesterin-SCLs (0/100) dienten als negative bzw. positive Kontrollen. f–i, Mittelwert + sd Die Anzahl der Beobachtungen (n) wird angegeben. P-Werte (Vergleich mit der Cholesterin-SCL-Bedingung in f,g und mit der 0/100-Bedingung in h,i) wurden mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse bestimmt. AU, beliebige Einheiten.

Quelldaten

Anhand von Lipidschichten ohne die morphologischen Merkmale der Cuticula analysieren wir die Rolle molekularer Anordnungen bei der Kontrolle der Bioadhäsion aus den antiadhäsiven Topographieeffekten der Collembola Cuticula5,14. Es wurde festgestellt, dass cholesterinhaltige Lipidschichten der Bioadhäsion durch einen bisher unbekannten entropischen Abstoßungsmechanismus entgegenwirken, der – anders als früher berichtete Grenzflächeneffekte15,16,17 – durch Orientierungsschwankungen verursacht wird.

Lipide der Collembola cuticula (Abb. 1d) wurden durch Spin-Coating in mehreren Schichten auf festen Trägern physiosorbiert (spin-coated lipid multilayers, SCLs; Abb. 1e). Für Cholesterin-SCLs zeigte die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie mit abgeschwächter Totalreflexion (ATR-FTIR) eine Mehrschichtstruktur, bei der die meisten Moleküle senkrecht zur Grenzfläche ausgerichtet waren (ergänzende Abbildung 2) 18, 19. Auf Gold chemisorbierte selbstorganisierte Monoschichten (SAMs; Abb. 1e) dienten als vergleichende Analyse der untersuchten Lipidkutikulakomponenten in geometrisch eingeschränkten molekularen Orientierungen (Extended Data Abb. 1 und 2a – c).

Ein Kennzeichen der Bioadhäsion ist die Bildung einer molekularen Konditionierungsschicht aus Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden und anderen Biomolekülen20. Dieser Prozess wurde durch Adsorptionsexperimente mit Lysozym und Albumin nachgeahmt. Die Ergebnisse zeigten deutlich geringere adsorbierte Proteinmengen an Cholesterin-SCLs als an allen anderen untersuchten SCLs und SAMs (Abb. 1f und erweiterte Daten Abb. 2f, g). Ebenso wurde festgestellt, dass die Adhäsion von grampositiven (Staphylococcus epidermidis, Stamm PCI 1200) und gramnegativen (Escherichia coli, Stamm W3110) Bakterien an Cholesterin-SCLs sehr gering ist (Abb. 1g und erweiterte Daten Abb. 2d, e). Durch die Analyse von Cholesterin-SCLs unterschiedlicher Schichtdicke (ergänzende Abbildung 3a) konnte jeglicher Einfluss der Mehrschichtdicke auf die antiadhäsiven Eigenschaften ausgeschlossen werden. Insbesondere SAMs von Thiocholesterin und N-(2-Mercaptoethyl)-3-hydroxy-5-cholensäureamid (Thiocholensäure) – also Ersatzstoffe für chemisch fixierte Cholesterin-Monoschichten mit entgegengesetzter molekularer Ausrichtung; Abb. 1e) – akkumulierte höhere Mengen an adsorbiertem Protein und anhaftenden Bakterien als Cholesterin-SCLs (Abb. 1f, g und erweiterte Daten Abb. 2d–g). Diese Beobachtung legt nahe, dass eine Einschränkung der molekularen Mobilität in geschichtetem Cholesterin die antiadhäsiven Eigenschaften beeinträchtigt. Eine teilweise Auflösung von Cholesterin-SCLs wurde durch die Analyse des gesamten organischen Kohlenstoffgehalts als Ursache für eine geringe Bioadhäsion ausgeschlossen (ergänzende Abbildung 4).

Da Cholesterin zusammen mit mehreren anderen Lipidkomponenten in der Collembola cuticula vorkommt (Abb. 1d), haben wir seine Relevanz für die Klebeeigenschaften von Mehrkomponenten-SCLs weiter untersucht. Es wurden Mehrkomponenten-SCLs untersucht, die Stearylpalmitat enthalten – ein Lipid, das eine starke Bioadhäsion an seinen Einzelkomponenten-SCLs verursacht (Abb. 1f, g und erweiterte Daten Abb. 2d, g) – und Cholesterin mit einem Cholesteringehalt im Bereich von 0 bis 100 Gew.-% unter Verwendung ähnlicher Bioadhäsionstests (Extended Data Abb. 3a – c). Mehrkomponenten-SCLs, die mindestens 10 Gew.-% Cholesterin enthielten, zeigten niedrige adhärente Zelldichten, ähnlich wie reine Cholesterin-SCLs (Abb. 1h und erweiterte Daten, Abb. 3d). Ebenso war die Proteinadsorption an Mehrkomponenten-SCLs signifikant verringert, wenn mindestens 1 Gew.-% Cholesterin vorhanden war (Extended Data Abb. 3e, f). Die Ergebnisse von Einzelproteinadsorptionsexperimenten wurden bei der Anwendung physiologisch relevanter Proteinmischungen (d. h. 10 Vol.-% fötales Rinderserum; Abb. 1i) bestätigt.

Die Ergebnisse der Bioadhäsionstests legen nahe, dass die Mobilität des Grenzflächencholesterins der Schlüssel zu den antiadhäsiven Eigenschaften von Einzel- und Mehrkomponenten-SCLs ist. Auf Atomkraftmikroskopie (AFM) basierende Kolloidsondenkraftspektroskopie, AFM-basierte Einzelzellkraftspektroskopie und dynamische Kontaktwinkelmessungen lieferten weitere Einblicke in die zugrunde liegende Grenzflächendynamik.

AFM-basierte Kraftspektroskopie (ergänzende Abbildungen 5a, b und Methoden) zeigte die dynamische Grenzflächenanpassung eingetauchter Cholesterin-SCLs. Die Wechselwirkungskräfte zwischen hydrophoben kolloidalen Sonden (ergänzende Abbildung 5c) oder einzelnen E. coli-Zellen und Cholesterin-SCLs wurden quantifiziert (ergänzende Abbildung 5d) und es wurde festgestellt, dass sie mit der Kontaktzeit kontinuierlich zunahmen (Abb. 2a, b). Weitere Analysen zeigten, dass die Kinetik dritter Ordnung den zugrunde liegenden Polaritätsanpassungsprozess der SCL-Schnittstelle steuerte, um hydrophobe Wechselwirkungen zu maximieren (Abb. 2a, b und Ergänzende Anmerkung 1). Kontrollexperimente mit Thiocholesterin- und Thiocholensäure-SAMs bestätigten, dass die Cholesterinmobilität innerhalb von SCLs der Schlüssel zur beobachteten Anpassung ist (Abb. 2a, b).

a,b, Kontaktzeitabhängige Wechselwirkungskräfte (bestimmt durch AFM-basierte Kraftspektroskopie) zwischen einer hydrophoben kolloidalen Sonde (a) (∅10 µm Silikatkügelchen, modifiziert mit einem hydrophoben Silan) oder einzelnen E. coli-Zellen (b) (befestigt). zu einem ∅10 µm großen Silikatkügelchen) und Cholesterin-SCLs oder Thiocholesterin- und Thiocholensäure-SAMs. Die Experimente wurden bei 37 °C durchgeführt. a,b, Mittelwert ± Standardabweichung. Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten erhalten. Regressionen sind die am besten geeigneten Lösungen für einen Prozess dritter Ordnung, der die Bildung von Bindungen an der Grenzfläche zwischen Sondenzelle und SCL nach \(\frac{{\rm{d}}\sigma }{{\rm{d}}t} anzeigt. =-\,k{\sigma }^{3}\) (Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 1). Es wurde angenommen, dass die Wechselwirkungskraft direkt mit der Oberflächenkonzentration der gebildeten Bindungen σ korreliert. Bestimmtheitsmaße (R2) für Anpassungen werden angezeigt. c, Repräsentative Bilder, die die dynamischen Kontaktwinkel von Wasser auf der Oberfläche einer Cholesterin-SCL zeigen. Der hohe fortschreitende Kontaktwinkel (θadv, blaue Box) spiegelt eine hydrophobe Oberfläche wider. Nach dem sofortigen Rückzug des Tropfens (keine Ruhephase, grüne Box) wurde ein leicht verringerter, aber immer noch hoher Rückzugskontaktwinkel (θrec) beobachtet. Es wurde kein Rückzug der dreiphasigen Kontaktlinie beobachtet, als der Wassertropfen nach einer Ruhezeit von 20 s zurückgezogen wurde (roter Kasten). d, Während der 20-sekündigen Ruhephase wurden Schwingungen in der dreiphasigen Kontaktlinie zwischen dem anfänglichen Vorschubwinkel (93°) und einem etwa 10° niedrigeren Winkel beobachtet.

Quelldaten

Dynamische Benetzungsexperimente an Cholesterin-SCLs in Luft zeigten hohe vorrückende und zurückweichende Wasserkontaktwinkel, wenn das Tröpfchen unmittelbar nach der Abscheidung zurückgezogen wurde (Abb. 2c, erweiterte Daten Abb. 4a und Zusatzvideo 1), was darauf hinweist, dass die Kohlenwasserstoffketten der äußeren Cholesterinschichten an der Luft konditionierten Materialien sind bevorzugt zur Grenzfläche ausgerichtet. Wenn der Wassertropfen 20 s lang auf der Oberfläche belassen wurde, bevor er sich zurückzog, kam es 15–20 s lang zu Schwingungen der dreiphasigen Kontaktlinie, und anschließend war der statische Kontaktwinkel um etwa 10 ° geringer (Abb. 2d und Zusatzvideo 2). . Beim Herausziehen des Tröpfchens wurde eine Fixierung der dreiphasigen Kontaktlinie beobachtet (Abb. 2c, erweiterte Daten Abb. 4a und Zusatzvideo 2). Es wurde festgestellt, dass der Kontaktwinkelabfall nach dem Trocknen in Inertgas vollständig reversibel ist (Extended Data Abb. 4d). Die ruheperiodenabhängige Abnahme des Kontaktwinkels, die oszillierende dreiphasige Kontaktlinie während der Ruheperiode und die erhöhte Kontaktwinkelhysterese bestätigen eine dynamische Polaritätsanpassung von Cholesterin an der Schnittstelle der SCLs als Reaktion auf Änderungen der Polarität die Umgebung.

Die Zeitabhängigkeit des Anstiegs der Wechselwirkungskraft zwischen Cholesterin-SCLs und AFM-Sonden (Abb. 2a) und einzelnen Bakterienzellen (Abb. 2b) sowie die Abnahme des zurückweichenden Wasserkontaktwinkels auf Cholesterin-SCLs (Abb. 2c) weisen darauf hin dass der Prozess der Anpassung der Grenzflächenpolarität von Cholesterin-SCLs relativ langsam ist (d. h. über einen Zeitraum von einigen Sekunden abläuft).

Die Ergebnisse der Bioadhäsionstests (Abb. 1h, i und Extended Data Abb. 3d – f) untermauern auch die Tatsache, dass geringe Mengen an Cholesterin in Mehrkomponenten-SCLs aus Cholesterin und Stearylpalmitat ausreichten, um den zurückgehenden Wasserkontaktwinkel zu verringern (Extended Data Abb. 4c). ) und um die Wechselwirkungskraft mit hydrophoben AFM-Sonden zu erhöhen (Extended Data Abb. 3h).

Wie oben gezeigt wurde, korrelieren die antibioadhäsiven Eigenschaften cholesterinhaltiger SCLs mit einer dynamischen Anpassung der Grenzflächenorientierung von Cholesterin als Reaktion auf Änderungen der Umweltpolarität. Wir stellten die Hypothese auf, dass entropisch bedingte Orientierungsfluktuationen von Grenzflächencholesterinmolekülen diese Merkmale mechanistisch verbinden: Jede Adsorption von Biomolekülen oder die Anheftung von (Bakterien-)Zellen erfordert eine Orientierungsanpassung (Polarität) der SCL-Grenzfläche, die die Orientierungszustände von Grenzflächencholesterin einschränkt und dadurch reduziert Entropie des Systems.

Um diese Hypothese zu bestätigen, untersuchten wir zunächst das System auf die charakteristische Temperaturabhängigkeit entropischer Effekte auf die Proteinadsorption (gemäß der Definition der freien Gibbs-Adsorptionsenergie, \(\Delta G=\Delta H\,\mbox{--} \,T\Delta S\)) unter Verwendung von drei ausgewählten Proteinen zunehmender Größe und Komplexität: Lysozym, Albumin und Fibrinogen. Tatsächlich wurde beobachtet, dass die Proteinadsorption an Cholesterin-SCLs abnahm, wenn die Temperatur von 15 auf 40 °C erhöht wurde (d. h. in einem Temperaturbereich, in dem signifikante temperaturbedingte Änderungen der Proteinkonformation ausgeschlossen werden können21,22,23). Im Gegensatz zu geringfügigen Änderungen in ähnlichen Experimenten mit Thiocholesterin- und Thiocholensäure-SAMs (orientierungsfixierte Kontrollen von Cholesterin-SCLs unter dem adsorbierten Protein) (Abb. 3a und erweiterte Daten Abb. 5a, b). Im thermischen Adsorptionsgleichgewicht kann die Temperaturabhängigkeit der freien Gibbs-Adsorptionsenergie verwendet werden, um die abstoßende entropische Barriere (ΔSchol) für die Proteinadsorption an Cholesterin-SCLs quantitativ abzuschätzen. Eine quantitative Analyse der Adsorption (basierend auf den Steigungen von ΔG(T) auf Cholesterin-SCLs und den SAM-Kontrollen) wurde für Lysozym durchgeführt, da adsorptionsinduzierte Strukturänderungen für das kleine, kompakte Protein vernachlässigbar sind und \(\Delta {S }_{{\rm{chol}}}=-\,200\,\pm \,60\,{\rm{J}}{{\rm{mol}}}^{-1}{{\rm {K}}}^{-1}\) (Erweiterte Daten Abb. 5c und Ergänzende Anmerkung 2)14,24. Dieser Wert von ΔSchol zeigt eine signifikante entropische Abstoßung, die der Bioadhäsion an Cholesterin-SCLs entgegenwirkt. Das Diagramm von ΔG(T) für Cholesterin-SCLs zeigt eine positive Steigung (d. h. ein negatives ΔS der Adsorption), was darauf hindeutet, dass die entropische Abstoßung jeglichen entropischen Gewinn der Proteinadsorption für dieses System überkompensiert. Während desorptionsbedingte Prozesse möglicherweise eine ähnliche Temperaturabhängigkeit aufweisen, ist die Proteinadsorption bekanntermaßen stark von der Adsorption bestimmt24.

a, Temperaturabhängige adsorbierte Mengen an Lysozym, bestimmt durch Quarzkristall-Mikrowaagenmessungen. Für Cholesterin-SCLs wurde eine ausgeprägte Temperaturabhängigkeit der Lysozym-Adsorption beobachtet. Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gewonnen. Mittelwert ± SD b, schematische Darstellung des Übergangs von Grenzflächencholesterin vom orientierungsschwankenden (ungebundenen) zum orientierungsbeschränkten (proteingebundenen) Zustand. Es wird gezeigt, dass drei ausgerichtete Cholesterinmoleküle die kooperative Neuorientierung benachbarter Moleküle innerhalb von SCLs hervorheben, die aus geometrischen Überlegungen abgeleitet und durch die experimentell beobachtete Kinetik dritter Ordnung der Grenzflächenanpassung und der Orientierungskorrelationslänge in MD-Simulationen belegt wird (Ergänzende Anmerkungen 1 und 4). Der entropische Nachteil der Bioadhäsion kann aus dem Verhältnis von Zwangs- und fluktuierenden Grenzflächenflächen, ΔS = R × ln(Aconstr/Afluct), von Cholesterinmolekülen abgeschätzt werden, wobei Afluct aufgrund der kooperativen Orientierungsfluktuation ungefähr der molekularen Dimension von Cholesterin entspricht Aconstr bezog sich auf die Querschnittsfläche des Cholesterins, die im proteingebundenen Zustand der Grenzfläche zugewandt ist (Ergänzende Anmerkung 3). c, MD-Simulationen von Cholesterin-Mehrfachschichten in Kontakt mit Wasser, mit Gleichgewichtszustand (links) und absichtlich umgekehrter molekularer Ausrichtung von 10 % der Moleküle in der Grenzschicht (rechts) (Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 4). Sauerstoffatome von Hydroxylgruppen werden als orangefarbene Kugeln dargestellt. d, Winkel zwischen dem Vektor, der die Atome C3 und C17 auf Cholesterin und Stigmasterol verbindet (Extended Data Abb. 6c und Ergänzende Anmerkung 4) und der z-Achse für Grenzflächenmoleküle als Funktion der Simulationszeit für eine repräsentative Simulationstrajektorie. In Cholesterin-Mehrschichtsystemen mit 10 % revertierten Molekülen wurde eine spontane Rückreorientierung innerhalb von 1 µs Simulationszeit beobachtet. Bei den Stigmasterol-Kontrollen wurde keine Rückwärtsorientierung beobachtet. e, Korrelationsfunktion (Cr) als Funktion des Abstands zu einem Referenzmolekül, aufgetragen für drei Simulationstrajektorien von Cholesterin-Mehrschichtsystemen (ohne veränderte Orientierung der Moleküle an der Grenzfläche). Fehlerbalken stellen die SD an diesem Punkt über Zeitintervalle dar. f, Mittlere quadratische Abweichung (RMSD) (für Cholesterin-Mehrfachschichten und Stigmasterin-Kontrollen) über drei Simulationstrajektorien der z-Komponente der Position aller O-Atome an der Grenzflächenschicht als Funktion der Zeit für Frames alle 0,01 µs, mit Fehler Balken bezeichnen sem g, normalisierte Wechselwirkungskräfte zwischen hydrophoben AFM-Spitzen und Cholesterin-SCL- oder Thiocholesterin-SAM-Oberflächen. Jede Kurve enthält 16 Datenpunkte, die nacheinander an derselben Stelle auf dem Substrat aufgezeichnet wurden. Einzelne Datensätze wurden an verschiedenen Stellen des Substrats erfasst. Kurven werden auf den Durchschnitt jedes Datensatzes normalisiert. Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gewonnen.

Quelldaten

Es wurde zuvor berichtet, dass entropische Abstoßungseffekte entweder aufgrund der fixierten Konformationsflexibilität von gepfropften Oligo(ethylenglykol)-15- und Polyethylenglykol-Bürsten16 oder einer erzwungenen Glättung von Höhenschwankungen von Lipiddoppelschichten auftreten17. Hierin wird vermutet, dass die entropische Abstoßung von Cholesterin-SCLs mechanistisch sehr unterschiedlich ist und hauptsächlich durch polaritätskontrollierte Orientierungsschwankungen bestimmt wird: Der entropische Nachteil für die Unterdrückung von Orientierungsschwankungen von Cholesterinmolekülen an der SCL-Grenzfläche bei der Proteinadsorption kann durch die Korrelation des Kreuzes abgeschätzt werden - Schnittfläche des Protein-zugewandten Cholesterins an der SCL-Grenzfläche zum Bereich des orientierungsfreien Cholesterins an der SCL-Lösungs-Grenzfläche (Abb. 3b und Ergänzende Anmerkung 3)18,19. Der erhaltene Wert für diesen Entropienachteil (–160 J mol–1 K–1) liegt nahe an der experimentell bestimmten entropischen Abstoßungsbarriere, die aus temperaturabhängigen Proteinadsorptionsexperimenten abgeleitet wurde (–200 J mol–1 K–1). Dieser ziemlich große Entropieverlust pro adsorbierendem Lysozymmolekül, der etwa drei Wasserstoffbrückenbindungen entspricht, unterstreicht die Relevanz des unbedeckten abstoßenden Effekts. Bei dieser Abschätzung des Entropienachteils wurde angenommen, dass drei assoziierte Cholesterinmoleküle an der Grenzfläche kooperativ an Orientierungsfluktuationen beteiligt sind, was zunächst durch geometrische Überlegungen zur molekularen Packung von Cholesterin in SCLs begründet wurde. Zeitabhängige Wechselwirkungskraftmessungen (Abb. 2a, b), die eine Kinetik dritter Ordnung zeigen, stützen diese Annahme, da die Daten auf kooperative Wechselwirkungen mit drei Cholesterinmolekülen hinweisen (Abb. 3b).

Die Analyse von Adsorptionsexperimenten mit den größeren Proteinen Albumin und Fibrinogen ergab niedrigere Werte für die geschätzte abstoßende Entropiebarriere (wahrscheinlich aufgrund von Entropieeffekten von Konformationsänderungen; Ergänzende Anmerkung 2). Es zeigte sich jedoch auch ein negativer (abstoßender) Entropiebeitrag von Cholesterin-SCLs, was auf die allgemeine Relevanz des neu identifizierten Antiadhäsionsmechanismus hinweist.

In einem völlig unabhängigen Ansatz wurden Cholesterin-Mehrfachschichten in Kontakt mit Wasser durch Molekulardynamiksimulationen (MD) untersucht und zeigten in ähnlicher Weise die Relevanz molekularer Orientierungsschwankungen (Ergänzende Anmerkung 4). Unter Verwendung von Gleichgewichts-Mehrschichtsystemen und gesteuerten MD-Simulationen mit umgekehrter Ausrichtung eines variablen Prozentsatzes von Grenzflächencholesterinmolekülen beobachteten wir eine spontane Neuorientierung dieser Moleküle innerhalb einer Simulationszeit von 1 µs, sodass sich ihre Hydroxylgruppen wieder in Richtung der Wasserschicht ausrichteten (Abb. 3c, d und). Erweiterte Daten Abb. 6b,d). Wichtig ist, dass Kontrollsimulationen mit dem Cholesterinanalogon Stigmasterol (Abb. 4) diese spontane molekulare Neuorientierung nicht zeigten (Abb. 3c, d und erweiterte Daten Abb. 6b, d). Die Orientierungskorrelationsfunktion von Cholesterinmolekülen in der Grenzflächenschicht zeigte einen schnellen Zerfall über eine Distanz von 1 nm (Abb. 3e) und bestätigte die oben diskutierte Orientierungskooperativität einiger (zwei oder drei) Cholesterinmoleküle. Zusammen mit der Beobachtung einer starken vertikalen Fluktuation der Grenzflächenschicht von Cholesterin-Mehrschichtschichten (Abb. 3f) stützen die MD-Simulationen die Ansicht, dass Cholesterin-SCLs eine hochdynamische und fluktuierende molekulare Grenzfläche darstellen.

Bioadhäsion an SCLs von Cholesterinanaloga (polare Hydroxylgruppen in rot dargestellt). Um den Vergleich zu erleichtern, wurde ein Bioadhäsionsindex eingeführt, indem die Ergebnisse von bakteriellen Adhäsionsexperimenten mit E. coli- und S. epidermidis-Zellen und Proteinadsorptionsexperimenten mit Rinderserumalbumin, Lysozym und fötalem Rinderserum aggregiert wurden (die vollständigen experimentellen Ergebnisse finden Sie unter Erweiterte Daten Abb. 10), alle normalisiert auf die entsprechenden Ergebnisse für Cholesterin-SCLs. Der Referenzwert wurde anhand der jeweiligen Kontrollen aus Bakterienadhäsions- (SiO2) und Proteinadsorptionstests (Gold) berechnet. AU, beliebige Einheiten.

Quelldaten

Um direkte experimentelle Beweise für Orientierungsschwankungen von Cholesterin an SCL-Grenzflächen zu erhalten, haben wir eine AFM-basierte Kraftkartierung angewendet, um die gleichzeitige Exposition polarer und unpolarer Reste eingetauchter Cholesterin-SCLs zu erfassen (Extended Data, Abb. 7). Die niedrigen und hohen Wechselwirkungskräfte zwischen einer hydrophoben AFM-Spitze und Thiocholensäure- oder Thiocholesterin-SAMs erstrecken sich über den Bereich der für Cholesterin-SCLs nachgewiesenen Wechselwirkungskräfte und bestätigen, dass sowohl polare als auch unpolare Reste an der Grenzfläche von eingebetteten Cholesterin-SCLs freigelegt werden (Erweitert). Daten Abb. 7c). Wiederholte Kraft-Abstandsmessungen an einer konstanten Position zeigten wesentlich größere Schwankungen bei Cholesterin-SCLs als bei Thiocholesterin-SAMs und lieferten damit den Beweis für Orientierungsschwankungen von Cholesterin an der SCL-Grenzfläche (Abb. 3g und erweiterte Daten Abb. 8).

Die entdeckte entropische Barriere für die Bioadhäsion, die aus Orientierungsschwankungen an der Grenzfläche cholesterinhaltiger SCLs resultiert, wirft die Frage auf, welche wichtigen Strukturmerkmale von Cholesterin diesem Effekt zugrunde liegen.

Daher haben wir die Bioadhäsionseigenschaften von SCLs, die aus strukturell verwandten Cholesterinanaloga hergestellt wurden (Abb. 4 und Extended Data Abb. 9), im Hinblick auf Bakterienadhäsion und Proteinadsorption (Extended Data Abb. 10) verglichen. Die Ergebnisse bestätigten, dass die molekulare Amphiphilie für eine niedrige Bioadhäsion wesentlich – aber nicht ausreichend – ist (Abb. 4 zeigt die Ergebnisse verschiedener Tests, zusammengefasst in einem Bioadhäsionsindex) und zeigten, dass selbst kleine Abweichungen in der molekularen Struktur von Cholesterin seine antiadhäsive Leistung stark beeinträchtigen können . Nur die SCLs von Dehydrocholesterin, dem nächsten chemischen Verwandten der getesteten Cholesterinanaloga, erreichten den Bioadhäsionsindex der Cholesterin-SCLs.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich Cholesterin in molekularen Anordnungen ansammelt, die in der Lage sind, die Bioadhäsion entropisch einzuschränken. Die Kombination der räumlich entkoppelten Amphiphilie von Cholesterin und seiner effektiven Ausrichtung in Multischichten, die eine langsam adaptive, kooperative Orientierungsmobilität der Anordnungen an der Grenzfläche erzeugt, wurde als Voraussetzung für eine ausgeprägte entropische Abstoßung identifiziert.

Die von der Ruhezeit abhängige Abnahme des zurückgehenden Wasserkontaktwinkels weist darauf hin, dass unter den verglichenen Cholesterinanaloga nur Cholesterin- und Dehydrocholesterin-SCLs diese Kriterien erfüllen (Extended Data, Abb. 9d). Messungen der Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP) an Cholesterin-SCLs, die laterale Diffusionskoeffizienten von 0,3–0,4 µm2 s–1 liefern, unterstützen zusätzlich die geordneten, aber langsam adaptiven Eigenschaften des Systems, vergleichbar mit smektischen Flüssigkristallen und Lipidmembranen mit hohem Cholesteringehalt (Ergänzende Abbildung 6)25,26.

In Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen zeigen MD-Simulationen, dass sich SCLs von Analoga mit leichten Strukturmodifikationen in Bezug auf Cholesterin (Extended Data Abb. 9d) deutlich anders verhalten, ohne dass es innerhalb der Simulationszeit zu spontanen Rückrotationen der umgekehrten Moleküle kommt (Abb. 3d). und Erweiterte Daten Abb. 6b,d). Die Simulationen deuten auch darauf hin, dass Stigmasterol-SCLs deutlich geringeren Grenzflächenschwankungen unterliegen als Cholesterin-SCLs, was darauf hindeutet, dass die spezifischen intermolekularen Wechselwirkungen von Cholesterin für eine hohe Grenzflächenmobilität sorgen und spontane molekulare Schwankungen ermöglichen (Abb. 3f und Extended Data Abb. 6f). Diese Ergebnisse stützen nachdrücklich die experimentell abgeleiteten Kriterien für amphiphile Moleküle, die in der Lage sind, entropisch abstoßende Anordnungen zu erzeugen.

Bei der Untersuchung der Zusammensetzung der Verteidigungslinie der antiadhäsiven Collembola cuticula identifizierten wir physikochemische Merkmale cholesterinhaltiger Schichten, die zu einer wirksamen entropischen Abstoßung führen. Angesichts des weit verbreiteten Vorkommens von Cholesterin an Gewebegrenzen könnten unsere Ergebnisse neues Licht auf wichtige und allgegenwärtige Grenzflächenprozesse lebender Materie werfen. Die Entwicklung von Cholesterin-inspirierten synthetischen und skalierbaren Materialien zur Kontrolle der Bioadhäsion ist äußerst attraktiv, erfordert jedoch weitere Analysen der molekularen Anforderungen, die diesen neu identifizierten Mechanismus steuern.

Alle in diesem Artikel verwendeten Chemikalien (Lösungsmittel, Lipide, Medien, Proteine ​​usw.) wurden ohne weitere Reinigung von Sigma-Aldrich erworben, sofern nicht anders angegeben.

SCLs wurden auf Siliziumwafern (10 × 15 mm2) hergestellt. Die Substrate wurden durch Eintauchen in eine Lösung aus entionisiertem Wasser, Ammoniak und Wasserstoffperoxid (Volumenanteil 5/1/1) für 15 Minuten bei 70 °C gereinigt, wiederholt in Milli-Q-Wasser gespült und dann in einem Stickstoffstrom getrocknet. Die gereinigten Substrate wurden sofort zur Herstellung von SCLs durch Schleuderbeschichtung verwendet. Die Verbindungen wurden in Chloroform in einer Konzentration von 2 Gew.-% gelöst (sofern nicht anders angegeben), und das Schleuderbeschichten (LabSpin6, SÜSS MicroTec) wurde 30 s lang bei 3.000 U/min s–1 durchgeführt.

Siliziumwafer wurden wie für die SCL-Vorbereitung beschrieben gereinigt. Saubere Substrate wurden zunächst mit einer 3 nm dicken Chromhaftschicht und anschließend einer 50 nm dicken Goldschicht durch chemische Gasphasenabscheidung bei 5 × 10–5 mbar (Univex 300, Leybold) beschichtet. Goldsubstrate wurden durch Eintauchen in eine Lösung aus entionisiertem Wasser, Ammoniak und Wasserstoffperoxid (Volumenanteil 5/1/1) für 15 Minuten bei 70 °C gereinigt, wiederholt in Milli-Q-Wasser gespült und dann in einem Stickstoffstrom getrocknet. Um Defekte zu minimieren, wurden die Goldsubstrate unmittelbar nach der Reinigung zur SAM-Bildung verwendet. Thiolverbindungen wurden in Ethanol (analytisch rein, pa) bis zu einer Konzentration von 1 mM gelöst. Vor der Verwendung wurden Thiollösungen 5–10 Minuten lang mit Ultraschall behandelt. Goldbeschichtete Substrate wurden zusätzlich 30 Minuten lang in Ethanol (pa) im Ultraschallbad gereinigt. Anschließend wurden die Proben in Thiollösungen getaucht und 24 Stunden lang inkubiert, um einen vollständigen Zusammenbau sicherzustellen. Behälter mit der Lösung und den Proben wurden mit trockenem Stickstoff gefüllt und versiegelt, um die Sauerstoffexposition zu minimieren. Nach der Inkubation wurden die Probenoberflächen 15–20 s lang mit Ethanol (pa) gespült, unter Stickstoff getrocknet und direkt für weitere Experimente verwendet.

Das Reaktionsschema finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. Ein Äquivalent 3-Acetoxy-5-cholensäure (A) wurde in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Die Lösung wurde auf Eis gerührt und sechs Äquivalente Carbonyldiimidazol (B), gelöst in wasserfreiem DMSO, wurden langsam zu der Lösung gegeben. Zur Aktivierung wurde die Reaktionsmischung über Nacht bei 4 °C gelagert. Eine Lösung von 2,5 Äq. Cystamin (D) wurde tropfenweise zu dem gerührten, eisgekühlten Imidazol-Zwischenprodukt (C) gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das Produkt (E) wurde gereinigt, gefriergetrocknet, in Ethanol gelöst und vor der Zugabe von 1 M NaOH zur Esterspaltung in Wasser verdünnt. Nach der Reinigung und Lyophilisierung wurde das Produkt (F) erneut in Ethanol gelöst und in Wasser verdünnt. Die Disulfidbindung wurde durch Zugabe eines sechsfachen Überschusses an Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid zu Cholensäure in wässriger Lösung bei neutralem pH-Wert gespalten. Das Spaltprodukt (G) wurde gereinigt und lyophilisiert (Reinheit etwa 80 %). Zur Reaktions-/Reinheitskontrolle und Reinigung wurde Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in Wasser mit Zusatz von Ameisensäure oder Trifluoressigsäure verwendet. Das analytische HPLC-Gerät (1260 Infinity II, Agilent) war mit einem Diodenarray-Detektor (210 und 278 nm) und einem Elektronenspray-Ionisations-Time-of-Flight-Detektor (ESI-TOF) ausgestattet. Das präparative HPLC-Gerät (Serie 1200, Agilent) verwendete einen Diodenarray-Detektor und einen Fraktionssammler im manuellen Sammelmodus.

Der Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff (TOC) der Lösungen wurde mit einem Labor-TOC-Analysator Sievers 5310C (GE Analytical Instruments) gemäß den Angaben des Herstellers analysiert. Informationen zur Probenvorbereitung finden Sie in der ergänzenden Abbildung 4.

S. epidermidis (Stamm PCI 1200, ATCC) und E. coli (Stamm W3110) wurden über Nacht aus einzelnen Kolonien in Lysogenie-Brühe (LB) bei 37 °C und 200 U/min gezüchtet. Übernachtkulturen wurden 5 Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das verbleibende Pellet in LB resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde dreimal wiederholt. Die Zelldichten wurden auf eine optische Dichte (OD600) von 0,2 in frischem LB eingestellt und die Probensubstrate wurden 1 Stunde lang bei 37 °C (ohne Schütteln) in der Bakterienlösung inkubiert. Nach der Inkubation wurden anhaftende Bakterien 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert, in frischem PBS und Milli-Q-Wasser gewaschen und unter Stickstoff getrocknet. Die Proben wurden mit einer 15 nm dicken Goldschicht (SCD 050, Balzers) sputterbeschichtet und durch Rasterelektronenmikroskopie (REM; XL30 ESEM-FEG, Philips/FEI) im Hochvakuummodus bei einer Beschleunigungsspannung von 5 kV abgebildet. Für jede Probe wurden mindestens sechs Bilder an zufälligen Positionen aufgenommen und die Zellen mit dem Zählgerät in Fidschi27 gezählt. Die Maßstabsbalken von REM-Bildern wurden zur Kalibrierung der Pixelbreite verwendet. Das Fiji-Plugin „Zellzähler“ wurde verwendet, um die Anzahl der Zellen im berechneten Bereich (ca. 103 µm2) zu zählen. Die gezählten Zahlen wurden entweder für relative Vergleiche auf den Mittelwert der Siliziumreferenz normalisiert oder für absolute Werte auf Zellen pro Quadratmillimeter hochskaliert.

Messungen der Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) wurden mit einem QCM-D Modell E4 (Biolin Scientific) durchgeführt, das mit einem peristaltischen Pumpensystem (IPC, Ismatec) ausgestattet war. Für QCM-Messungen wurden goldbeschichtete Quarzkristalle (QSX301, Quantum Design) mit einer Resonanzfrequenz von 5 MHz verwendet. SCLs und SAMs wurden wie oben beschrieben auf QCM-Kristallen hergestellt. Alle Messungen wurden bei einer Flussrate von 100 µl min−1 durchgeführt. Proteinlösungen (Lysozym, Rinderserumalbumin und Fibrinogen (100 µg Protein ml–1 PBS)) oder 10 Vol.-% fötales Rinderserum (Merck) in PBS wurden 1 Stunde lang an den geschichteten Proben adsorbiert und anschließend 30 Stunden lang einem Desorptionsregime unterzogen min mit PBS. Durch die adsorbierten Proteine ​​induzierte Frequenz- und Dissipationsverschiebungen wurden in Echtzeit beim dritten, fünften, siebten, neunten, 11. und 13. Oberton (jeweils 15, 25, 35, 45, 55 und 65 MHz) aufgezeichnet. Die Masse des adsorbierten Proteins wurde mithilfe der Sauerbrey-Gleichung28 mit der Software Q-Sense DFind (Biolin Scientific) berechnet.

Kontaktwinkelmessungen wurden mit einem optischen Kontaktwinkelmess- und Konturanalysesystem OCA 30 durchgeführt, das mit einer temperaturgesteuerten TPC 160-Kammer (DataPhysics Instruments) ausgestattet war. Tröpfchen entgasten entionisierten Wassers wurden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten von 0,3–2,0 µl s–1 abgegeben und erneut abgegeben, um fortschreitende und zurückgehende Kontaktwinkel und ihr zeitabhängiges Verhalten zu überwachen.

Ellipsometriemessungen wurden mit einem M-2000-Ellipsometer (JA Woollam) durchgeführt, das mit einer 50-W-QTH-Lampe ausgestattet war und bei Wellenlängen von 371 bis 1.000 nm und einem Einfallswinkel von 75° arbeitete. Die Oxidschichtdicke des Siliziumwafers wurde vor dem Schichtaufbau mittels Ellipsometrie bestimmt. Die Dicke der zusammengesetzten Schichten wurde durch ein optisches Modell berechnet, das drei Schichten umfasste: Si, SiO2 und eine Cauchy-Schicht.

Für die In-situ-ATR-FTIR wurden 500 µl einer 2 %igen Cholesterin-Chloroform-Lösung durch Schleuderbeschichtung auf einen Germanium-ATR-Kristall aufgetragen. Die Charakterisierung der abgelagerten Cholesterin-SCLs durch In-situ-ATR-FTIR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt . In-situ-ATR-FTIR-Spektroskopie wurde unter Verwendung der Einzelstrahl-Probenreferenztechnik durchgeführt, um kompensierte ATR-FTIR-Spektren in trockenen und wässrigen Umgebungen zu erhalten30,31. Dichroitische Messungen wurden gemäß einer zuvor beschriebenen Methode32 durchgeführt. Infrarotlicht wurde durch einen Drahtgitterpolarisator (SPECAC) polarisiert. Der ATR-FTIR-Aufsatz wurde an einem IFS 55 Equinox-Spektrometer (BRUKER Optics) betrieben, das mit einer Globar-Quelle und einem Quecksilber-Cadmium-Tellurid-Detektor ausgestattet war. P- und s-polarisierte Spektren wurden von trockenen Cholesterin-SCLs aufgezeichnet. Die hohen dichroitischen Verhältnisse der n(CO)-Bande der COH-Kopfgruppe von Cholesterin können anhand der ATR-FTIR-Dichroismusmessungen von Lipiddoppelschichten verifiziert werden. Das dichroitische Verhältnis R = AP/AS, wobei die Absorption Ap in p-Polarisation und AS in s-Polarisation gemessen wurde, von Infrarotbändern mit einem Übergangsdipolmoment (M), das senkrecht zur Oberflächenebene liegt, zeigte ebenfalls hohe Werte mit R > 4. Kurz gesagt, unter ATR-Bedingungen an der Grenzfläche zwischen dem dichten Medium (Si) und dem seltenen Medium (Luft) wurde eine evaneszente Welle mit einem elektrischen Feld erzeugt, das in die drei elektrischen Feldkomponenten Ex, Ey und Ez aufgeteilt wurde, die interagieren mit beispielsweise angrenzenden organischen Schichten. Parallel polarisiertes Infrarotlicht (EP) bildet Ex und Ez, während vertikal polarisiertes Licht (ES) Ey bildet. Hohe Werte von R oder Ap werden erhalten, wenn das M einer funktionellen Gruppe innerhalb der organischen Schicht parallel zu Ez (außerhalb der Ebene) liegt, wohingegen niedrige R- oder hohe AS-Werte erhalten werden, wenn M parallel zu Ey (in der Ebene) liegt. was auf das Skalarprodukt \(A=E\times M=E\times M\times \cos (E,M)\) der Vektoren E und M zurückzuführen ist.

Die Flugzeit-Sekundärionenmassenspektrometrie (ToF-SIMS) wurde mit einem ToF-SIMS 5-100-Instrument durchgeführt, das mit einer 30-kV-Bi-Flüssigmetall-Ionenkanone (IONTOF) ausgestattet war. Die Daten wurden im Bi3++-Modus erfasst und anhand einer Liste von Referenzpeaks (SurfaceLab7, IONTOF) kalibriert. Der Analysebereich betrug 300 × 300 µm2 und wurde mit 128 × 128 Pixeln gescannt. Die Probentiefe dieser Technik beträgt nur wenige Nanometer – das heißt, nur die obersten Molekülschichten der Probe tragen zur Analyse bei. Für die semiquantitative Charakterisierung von SCLs wurden charakteristische Signale von Cholesterin (Masse-Ladungs-Verhältnis, m/z = 369,3) und Stearylpalmitat (m/z = 257,2) ausgewählt.

Wir haben ein zuvor beschriebenes FRAP-Protokoll angewendet, um Diffusionskoeffizienten und mobile Fraktionen mit einem konfokalen Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskop unter Verwendung des FRAP-Tools (SP5, Leica) zu analysieren33,34. Für FRAP-Messungen wurden fluoreszierende Cholesterin-SCLs durch Zugabe von 1/100 oder 1/20 NBD-Cholesterin (ThermoFisher) zu reinen Cholesterinlösungen (2 Gew.-%) und Schleuderbeschichtung auf saubere Nr. hergestellt. 1,5 Glasdeckgläser (Corning). Cholesterin-SCLs wurden anschließend in entionisiertes Wasser oder PBS getaucht, und FRAP wurde durch Photobleichen eines definierten Flecks mit einem Durchmesser von 10 ± 1 µm unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt: zehn Bilder vor dem Bleichen, gefolgt von einem Hochleistungslaserstrahl mit anschließendem Bleichen für 4 s, um einen vollständig gebleichten Bereich zu erzielen. Die Erholung wurde mit einem Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur 40×/1,4 bei einer Bildaufnahmegeschwindigkeit von 1 s pro Bild bei 256 × 256 Pixeln für insgesamt 300 s aufgezeichnet (SP5, Leica). Der resultierende Zeitraffer wurde mit dem MATLAB-Programm (MathWorks) frap_analysis35 analysiert.

Alle AFM-Messungen wurden mit einem NanoWizard IV AFM (JPK Instruments) durchgeführt. Die verwendeten Ausleger wurden vor den Messungen kalibriert. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Messungen in PBS bei Raumtemperatur (25 °C) durchgeführt.

Die Oberflächentopographie der geschichteten Oberflächen wurde im Quantitative Imaging-Modus des AFM-Instruments unter Verwendung von qp-BioAC-Cantilevern (Nanosensoren) aufgezeichnet. Die verwendeten Erfassungsparameter waren wie folgt: 300-nm-Rampe, 10 ms Pixelzeit und Krafttrigger von 100 pN. Es wurden Bilder von 30 × 30 µm2 mit einer Auflösung von 256 × 256 Pixeln aufgenommen. Die vom AFM-Hersteller (JPK Instruments) bereitgestellte Datenverarbeitungssoftware wurde verwendet, um die Oberflächenrauheit (Ra) aus Topographiebildern zu extrahieren.

Für kolloidale Sondenmessungen wurden einzelne Silikatkügelchen (Kisker Biotech, Ø10 µm) wie zuvor beschrieben an einem spitzenlosen Ausleger (PNP-TR-TL-Au, Nanoworld, Nennkraftkonstante 0,08 N m–1) befestigt36. Mit kolloidalen Sonden modifizierte AFM-Ausleger wurden in Isopropanol gereinigt und adsorbiertes Wasser durch 10-minütiges Erhitzen auf 120 °C entfernt. Die kolloidale Sonde wurde durch 12-stündige Inkubation in Hexamethyldisilazan-Dampf und anschließendes einstündiges Erhitzen auf 120 °C hydrophobisiert. Die verwendeten Kraftspektroskopieparameter waren wie folgt: 3 nN Sollkraft, 5 µm s–1 Annäherungs-/Rückzugsgeschwindigkeit und 5 µm Zugweg. Interaktionskräfte wurden aus den Rückzugskraft-Abstands-Kurven mithilfe von Daten aus der vom AFM-Hersteller bereitgestellten Verarbeitungssoftware extrahiert.

Der durch kolloidale Sonden modifizierte AFM-Cantilever (siehe Abschnitt „Kolloidale Sondenkraftspektroskopie“) wurde durch Aufbringen einer Polydopaminbeschichtung zelladhäsiv gemacht, und einzelne E. coli-Zellen mit zytoplasmatischem grün fluoreszierendem Protein (Stamm MG1655 eGFP) wurden wie zuvor beschrieben befestigt37. Die Messungen wurden bei 37 °C mit einem PetriDishHeater (JPK Instruments) durchgeführt. Für kolloidale Sondenspektroskopiemessungen wurden die gleichen Kraftspektroskopieparameter und Datenverarbeitungsroutinen verwendet. Es wurden nur Datensätze analysiert, bei denen die Position und Ausrichtung der Bakterienzelle auf dem AFM-Ausleger vor und nach den Messungen unverändert war (d. h. die Kontaktbedingungen/Geometrie waren während der Messung konstant).

Die Messungen wurden im Quantitative Imaging-Modus des AFM-Instruments unter Verwendung von qp-BioAC-Cantilevern (CB-2, Nanosensoren) durchgeführt. Die Ausleger wurden entweder durch Inkubation in Hexamethyldisilazan-Dampf wie oben beschrieben hydrophobisiert oder durch Plasmareinigung (Harrick Plasma) für 10 Minuten hydrophilisiert. Die verwendeten Erfassungsparameter waren wie folgt: 100-nm-Rampe, 20 ms Pixelzeit und Krafttrigger von 500 pN. An verschiedenen Stellen der Probenoberfläche wurden Bilder von 5 × 5 µm2 mit einer Auflösung von 50 × 50 Pixeln aufgenommen. Interaktionskräfte wurden mithilfe der vom AFM-Hersteller bereitgestellten Datenverarbeitungssoftware aus Rückzugskraft-Abstandskurven extrahiert.

Zeitabhängige Kraftspektroskopiemessungen wurden mit hydrophobierten (siehe vorherigen Abschnitt) qp-BioAC-Cantilevern (CB-2, Nanosensors) durchgeführt. Die verwendeten Kraftspektroskopieparameter waren wie folgt: 1 nN Sollkraft, 1 µm s–1 Annäherungs-/Rückzugsgeschwindigkeit und 200 nm Zugstrecke. Zwischen den 16 aufeinanderfolgenden Messungen an einer einzelnen Stelle der Probenoberfläche wurde eine Wartezeit von 20 s eingehalten, um den Einfluss der Messungen auf die Dynamik von Cholesterinmolekülen zu minimieren. Die Messungen wurden an verschiedenen Stellen der Probe wiederholt. Interaktionskräfte wurden mithilfe der vom AFM-Hersteller bereitgestellten Datenverarbeitungssoftware aus Rückzugskraft-Abstandskurven extrahiert.

Cholesterin- oder Stigmasterin-SCLs mit vier Molekülschichten – also zwei Doppelschichten (Extended Data Abb. 6a) – wurden modelliert. An der Grenzfläche zweier Doppelschichten stehen sich die hydrophilen Hydroxylgruppen von Cholesterin oder Stigmasterol gegenüber; An der Grenzfläche sind Hydroxylgruppen der Wasserschicht zugewandt. Die Normale der Doppelschicht-Wasser-Grenzfläche verlief in allen Simulationen entlang der z-Achse. Um ein festes Substrat am Boden der SCL zu modellieren, wurde die Bewegung der Moleküle in der xy-Ebene für die untersten Lipidmoleküle eingeschränkt. Die Abmessungen der Simulationsbox betrugen 7,1554 × 7,1554 × 50 nm3. Hydrophobe Wände, modelliert als direktes 12-6-LJ-Potenzial bei z = 0 und z = 50 nm, wurden unten und oben in der Simulationsbox entlang der z-Achse eingefügt. Vakuumschichten über und unter der Mehrschicht verhindern nichtgebundene Wechselwirkungen zwischen Wasser, Wand und Lipidwand im Nahbereich.

Cholesterin- und Stigmasterinmoleküle wurden mit dem Kraftfeld CHARMM3638,39 modelliert. Das TIP3P-Wassermodell in CHARM40,41,42 wurde verwendet und berücksichtigte KCl-Salz in den Simulationen. Zunächst wurden auf CHARMM-GUI Doppelschichten aus Cholesterin oder Stigmasterol konstruiert, wobei die hydrophoben Schwänze einander zugewandt sind43,44. Die CHARMM36-Kraftfeldparameter für Cholesterin und Stigmasterol, die TIP3P-Wasserparameter und die Parameter für Ionen wurden von CHARMM-GUI erhalten. Jede Schicht der Doppelschicht aus Cholesterin oder Stigmasterin enthielt 128 Moleküle. Die aus CHARMM-GUI erhaltene Doppelschicht wurde mit dem Visual Molecular Dynamics-Visualisierungsprogramm45 entlang der z-Achse um 4 nm verschoben, wodurch Mehrschichten aus vier Schichten mit insgesamt 512 Lipidmolekülen konstruiert wurden (Extended Data Abb. 6a). Den Multischichten wurden Wasser und Ionen hinzugefügt. Das Cholesterin-Mehrschichtsystem enthielt 12.284 Wassermoleküle mit 72 K+- und Cl–-Ionen und das Stigmasterol-Mehrschichtsystem enthielt 12.363 Wassermoleküle mit 74 K+- und Cl–-Ionen. Das System wurde energieminimiert und Gleichgewichtssimulationen sowohl für cholesterin- als auch stigmasterinhaltige Systeme wurden mit Gromacs 2019.4 durchgeführt (Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 4)46,47.

Um die Systeme mit umgekehrter Molekülorientierung an der Grenzfläche (obere Schicht) aufzubauen, wurden 10 % (13 Moleküle), 30 % (39 Moleküle) und 50 % (64 Moleküle) der Moleküle im Vergleich zum Gleichgewichtssystem in ihrer Orientierung umgekehrt. Das Alchembed-Tool48 wurde verwendet, um etwaige Überlappungen zwischen Koordinaten zu entfernen, die beim Umkehren der Ausrichtung von Molekülen aufgetreten sein könnten. Anschließend wurden Minimierungs- und kurze Äquilibrierungsläufe wie oben beschrieben durchgeführt (Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 4).

Alle während dieser Studie generierten Daten werden unter https://is.gd/3cdZ6f bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Barthlott, W. & Neinhuis, C. Reinheit des heiligen Lotus oder Flucht vor Kontamination in biologischen Oberflächen. Planta 202, 1–8 (1997).

CAS Google Scholar

Wong, TS et al. Bioinspirierte, selbstreparierende rutschige Oberflächen mit druckstabiler Omniphobie. Natur 477, 443–447 (2011).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Hensel, R., Neinhuis, C. & Werner, C. Die Springschwanzkutikula als Blaupause für omniphobe Oberflächen. Chem. Soc. Rev. 45, 323–341 (2016).

CAS PubMed Google Scholar

Hensel, R. et al. Biologisch inspirierte omniphobe Oberflächen durch Reverse-Imprint-Lithographie. Adv. Mater. 26, 2029–2033 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Hensel, R. et al. Abstimmbare Nanoreplikation zur Erforschung der omniphoben Eigenschaften der Springschwanzhaut. NPG Asia Mater. 5, e37 (2013).

Helbig, R., Nickerl, J., Neinhuis, C. & Werner, C. Intelligente Hautmuster schützen Springschwänze. PLoS ONE 6, e25105 (2011).

Nickerl, J., Tsurkan, M., Hensel, R., Neinhuis, C. & Werner, C. Die mehrschichtige schützende Kutikula von Collembola: eine chemische Analyse. JR Soc. Schnittstelle 11, 20140619 (2014).

Koch, K. & Ensikat, HJ Die hydrophoben Beschichtungen von Pflanzenoberflächen: epikutikuläre Wachskristalle und ihre Morphologie, Kristallinität und molekulare Selbstorganisation. Mikron 39, 759–772 (2008).

CAS PubMed Google Scholar

Pohl, CH, Kock, JLF & Thibane, VS in Science Against Microbial Pathogens: Communicating Current Researchand Technological Advances Vol. 1 (Hrsg. Méndez-Vilas, A.) 61–71 (2011).

Desbois, AP & Smith, VJ Antibakterielle freie Fettsäuren: Aktivitäten, Wirkmechanismen und biotechnologisches Potenzial. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 85, 1629–1642 (2010).

CAS PubMed Google Scholar

Guenther, J., Wright, AD, Burns, K. & De Nys, R. Chemische Antifouling-Abwehr von Seesternen: Auswirkungen der Naturstoffe Hexadecansäure, Cholesterin, Lathosterol und Sitosterin. März Ecol. Prog. Ser. 385, 137–149 (2009).

ADS CAS Google Scholar

Van Meer, G., Voelker, DR & Feigenson, GW Membranlipide: wo sie sind und wie sie sich verhalten. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 9, 112–124 (2008).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Lingwood, D. & Simons, K. Lipidflöße als membranorganisierendes Prinzip. Wissenschaft 327, 46–50 (2010).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Hensel, R. et al. Benetzungsbeständigkeit an der topografischen Grenze: der Vorteil von Pilz- und Serifen-T-Strukturen. Langmuir 29, 1100–1112 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Li, L., Chen, S., Zheng, J., Ratner, BD & Jiang, S. Proteinadsorption auf selbstorganisierten Oligo(ethylenglykol)-terminierten Alkanthiolat-Monoschichten: die molekulare Basis für Nonfouling-Verhalten. J. Phys. Chem. B 109, 2934–2941 (2005).

CAS PubMed Google Scholar

Jeon, SI, Lee, JH, Andrade, JD & De Gennes, PG Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen in Gegenwart von Polyethylenoxid: I. Vereinfachte Theorie. J. Colloid Interface Sci. 142, 149–158 (1991).

ADS CAS Google Scholar

Lipowsky, R. im Handbook of Biological Physics Vol. 1 (Hrsg. Lipowsky, R. & Sackmann, EBT-H.) 521–602 (Nordholland, 1995).

Loomis, CR, Shipley, GG & Small, DM Das Phasenverhalten von hydratisiertem Cholesterin. J. Lipid Res. 20, 525–535 (1979).

CAS PubMed Google Scholar

Shieh, HS, Hoard, LG & Nordman, CE Kristallstruktur von wasserfreiem Cholesterin. Natur 267, 287–289 (1977).

ADS PubMed Google Scholar

Donlan, RM Biofilme: Mikrobielles Leben auf Oberflächen. Emerg. Infizieren. Dis. 8, 881 (2002).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Venkataramani, S., Truntzer, J. & Coleman, DR Thermische Stabilität von hochkonzentriertem Lysozym bei unterschiedlichen pH-Werten: eine Fourier-Transformations-Infrarotstudie. J. Pharm. Bioalliierte Wissenschaft. 5, 148–153 (2013).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Borzova, VA et al. Kinetik der thermischen Denaturierung und Aggregation von Rinderserumalbumin. PLoS ONE 11, e0153495 (2016).

Marx, G. et al. Hitzedenaturierung von Fibrinogen zur Entwicklung einer biomedizinischen Matrix. J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomaterial. 84B, 49–57 (2008).

CAS Google Scholar

Norde, W. Biokolloide und Biooberflächenenergie und Entropie der Proteinadsorption. J. Dispers. Wissenschaft. Technol. 13, 363–377 (1992).

CAS Google Scholar

Lockwood, NA, Gupta, JK & Abbott, NL Selbstorganisation von Amphiphilen, Polymeren und Proteinen an Grenzflächen zwischen thermotropen Flüssigkristallen und wässrigen Phasen. Surfen. Wissenschaft. Rep. 63, 255–293 (2008).

ADS CAS Google Scholar

Crane, JM & Tamm, LK Rolle von Cholesterin bei der Bildung und Beschaffenheit von Lipidflößen in planaren und sphärischen Modellmembranen. Biophys. J. 86, 2965–2979 (2004).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9, 676–682 (2012).

CAS PubMed Google Scholar

Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Z. Phys. 155, 206–222 (1959).

ADS CAS Google Scholar

Müller, M., Ouyang, W. & Keßler, B. Dichroitische ATR-FTIR-Spektroskopie an orientiertem α-helikalem Poly(l-lysin), mehrschichtig mit Polyanionen. Spektrochem. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 77, 709–716 (2010).

ADS PubMed Google Scholar

Fringeli, UP in Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry (Hrsg. Lindon, JC) 94–109 (Academic Press, 1999); https://doi.org/10.1016/B978-0-12-374413-5.00104-4.

Müller, M. et al. Eine In-situ-ATR-FTIR-Studie zu Polyelektrolyt-Mehrschichtanordnungen auf festen Oberflächen und ihrer Anfälligkeit für Verschmutzung. Makromol. Schnelle Kommuni. 19, 333–336 (1998).

Google Scholar

Müller, M. Orientierung von α-helicalem Poly(L-lysin) in nacheinander adsorbierten Polyelektrolyt-Mehrfachschichten auf texturierten Siliziumsubstraten. Biomakromoleküle 2, 262–269 (2001).

PubMed Google Scholar

Zimmermann, R. et al. Ladung und Struktur von zwitterionisch unterstützten Doppelschicht-Lipidmembranen, untersucht durch Strömungsstrommessungen, Fluoreszenzmikroskopie und abgeschwächte Totalreflexions-Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie. Biointerphases 4, 1–6 (2009).

PubMed Google Scholar

Axelrod, D., Koppel, DE, Schlessinger, J., Elson, E. & Webb, WW Mobilitätsmessung durch Analyse der Wiederherstellungskinetik der Fluoreszenz-Photobleichung. Biophys. J. 16, 1055–1069 (1976).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jönsson, P., Jonsson, MP, Tegenfeldt, JO & Höök, F. Eine Methode zur Verbesserung der Genauigkeit der Fluoreszenzwiederherstellung nach der Photobleichanalyse. Biophys. J. 95, 5334–5348 (2008).

ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krieg, M. et al. Zugkräfte bestimmen die Keimschichtorganisation im Zebrafisch. Nat. Zellbiol. 10, 429–436 (2008).

CAS PubMed Google Scholar

Beaussart, A. et al. Quantifizierung der Kräfte, die die mikrobielle Zelladhäsion steuern, mittels Einzelzell-Kraftspektroskopie. Nat. Protokoll. 9, 1049–1055 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Klauda, ​​JB et al. Aktualisierung des CHARMM-All-Atom-Additiv-Kraftfelds für Lipide: Validierung an sechs Lipidtypen. J. Phys. Chem. B 114, 7830–7843 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lim, JB, Rogaski, B. & Klauda, ​​JB Aktualisierung der Cholesterin-Kraftfeldparameter in CHARMM. J. Phys. Chem. B 116, 203–210 (2012).

CAS PubMed Google Scholar

Jorgensen, WL, Chandrasekhar, J., Madura, JD, Impey, RW & Klein, ML Vergleich einfacher Potentialfunktionen zur Simulation von flüssigem Wasser. J. Chem. Physik. 79, 926–935 (1983).

ADS CAS Google Scholar

Durell, SR, Brooks, BR & Ben-Naim, A. Lösungsmittelinduzierte Kräfte zwischen zwei hydrophilen Gruppen. J. Phys. Chem. 98, 2198–2202 (1994).

CAS Google Scholar

Neria, E., Fischer, S. & Karplus, M. Simulation freier Aktivierungsenergien in molekularen Systemen. J. Chem. Physik. 105, 1902–1921 (1996).

ADS CAS Google Scholar

Jo, S., Kim, T., Iyer, VG & Im, W. CHARMM-GUI: eine webbasierte grafische Benutzeroberfläche für CHARMM. J. Comput. Chem. 29, 1859–1865 (2008).

CAS PubMed Google Scholar

Lee, J. et al. CHARMM-GUI-Eingabegenerator für NAMD-, GROMACS-, AMBER-, OpenMM- und CHARMM/OpenMM-Simulationen unter Verwendung des additiven Kraftfeldes CHARMM36. J. Chem. Theorieberechnung. 12, 405–413 (2016).

CAS PubMed Google Scholar

Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: visuelle Molekulardynamik. J. Mol. Graph. 14, 33–38 (1996).

CAS PubMed Google Scholar

Van Der Spoel, D. et al. GROMACS: schnell, flexibel und kostenlos. J. Comput. Chem. 26, 1701–1718 (2005).

PubMed Google Scholar

Abraham, MJ et al. Gromacs: Hochleistungsmolekularsimulationen durch mehrstufige Parallelität vom Laptop bis zum Supercomputer. SoftwareX 1–2, 19–25 (2015).

ADS Google Scholar

Jefferys, E., Sands, ZA, Shi, J., Sansom, MSP & Fowler, PW Alchembed: eine rechnerische Methode zum Einbau mehrerer Proteine ​​in komplexe Lipidgeometrien. J. Chem. Theorieberechnung. 11, 2743–2754 (2015).

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Wir danken SW Grill, P. Fratzl, DJ Müller und K. Simons für ihre äußerst hilfreichen und ermutigenden Kommentare zu unserer Studie. Wir danken D. Hahn, M. Nitschke und M. Müller für die Synthese von Thiocholensäure, für die Durchführung von ToF-SIMS-Messungen bzw. für die Durchführung von ATR-FTIR-Messungen. LDR dankt der VolkswagenStiftung für die Unterstützung. Wir danken C. Neinhuis, dass er uns auf die faszinierenden Merkmale der Collembola-Nagelhaut aufmerksam gemacht hat.

Open access funding provided by Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden e.V.

Institut für Biofunktionelle Polymermaterialien, Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden, Dresden, Deutschland

Jens Friedrichs, Ralf Helbig, Julia Hilsenbeck, Lars David Renner, Tilo Pompe & Carsten Werner

Institut für Polymertheorie, Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden, Dresden, Deutschland

Prithvi Raj Pandey & Jens-Uwe Sommer

Cluster of Excellence Physics of Life and Center of Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden, Dresden, Germany

Jens-Uwe Sommer & Carsten Werner

Institut für Biochemie, Universität Leipzig, Leipzig, Deutschland

Tilo Pompe

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JF, RH, JH, TP und LDR haben Experimente entworfen und durchgeführt und Daten analysiert. PRP und J.-US führten Molekulardynamiksimulationen durch. JF, RH, JH, TP, J.-US, LDR und CW haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Carsten Werner.

JF, RH, LDR, TP, J.-US und CW sind als Miterfinder in der Patentanmeldung Nr. aufgeführt. 10 2022 104 237,5. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt Mingjie Liu, Jose Luis Toca-Herrera und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Molekulare Strukturen von Lipiden, die in der Kutikula der Collembola T. bielanensis7 nachgewiesen wurden, und von Lipiden, die bei der Herstellung von SCLs und SAMs verwendet werden. SCLs wurden aus Cholesterin, Palmitin- und Stearinsäure sowie Stearylpalmitat hergestellt. In der Cuticula wurden Cholesterin sowie Palmitin- und Stearinsäure nachgewiesen, und Stearylpalmitat ist ein Ersatz für die nachgewiesene Verbindung Linoleylpalmitat, die als synthetisches Material nicht in ausreichenden Mengen verfügbar war. Während beide Wachsester die gleichen Kohlenwasserstoffkettenlängen aufweisen, verfügt Linoleylpalmitat über zwei zusätzliche Doppelbindungen. Andere in der Cuticula nachgewiesene Lipide standen entweder nicht als synthetisches Material zur Verfügung oder waren für die Herstellung von SCLs ungeeignet (z. B. Öl- und Linolsäure sind bei Raumtemperatur Flüssigkeiten und werden nach dem Schleuderbeschichten sofort auf dem Substrat entnetzt). SAMs wurden unter Verwendung von Thiol-terminierten Lipiden hergestellt, die strukturell einigen der in der Collembola cuticula nachgewiesenen Lipide ähnelten. In Thiocholesterin wird die Hydroxylgruppe am 3. Kohlenstoffatom des Kohlenwasserstoffrings A des Cholesterins durch eine Thiolgruppe ersetzt, und in Choleninsäure wird die Cholesterinstruktur chemisch so modifiziert, dass sie am Ende der Kohlenwasserstoffkette am 17. Kohlenstoffatom eine Thiolgruppe trägt Kohlenstoffatom des Kohlenwasserstoffrings D (Einzelheiten zur Thiolierung von Cholensäure finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1). Hexadecanthiol, Octadecanthiol und Octadecenthiol sind Analoga der in der Cuticula nachgewiesenen Fettsäuren, während Thiohexylhexanoat einen kurzkettigen Ersatz für Stearylpalmitat darstellt.

(a) Schichtdicke, (b) Oberflächenrauheit (Ra) und (c) Morphologie der kutikulären Lipidschichten von Collembola, bestimmt durch Ellipsometrie (Schichtdicke) und Rasterkraftmikroskopie (Oberflächenrauheit und Morphologie). Alle Bilder in Tafel (c) haben den gleichen Maßstab. (d,e) Normalisierte adhärente Zelldichte von (d) S. epidermidis und (e) E. coli. Die Daten werden auf die durchschnittliche adhärente Zelldichte auf dem SiO2-Substrat normiert. (f,g) Adsorbierte Menge an (f) Lysozym und (g) Rinderserumalbumin, bestimmt durch Quarzkristall-Mikrowaagenmessungen. In allen Diagrammen werden der Mittelwert + die Standardabweichung angezeigt. Angegeben ist die Anzahl der Beobachtungen (n). P-Werte (Vergleiche mit der Cholesterin-SCL-Bedingung) wurden mithilfe von Einweg-ANOVA-Tests bestimmt.

Quelldaten

(a) Schichtdicke, (b) Oberflächenrauheit (Ra) und (c) Morphologie von Mehrkomponenten-SCLs, die Stearylpalmitat und Cholesterin in verschiedenen Gewichtsverhältnissen enthalten, bestimmt durch Ellipsometrie (Schichtdicke) und Rasterkraftmikroskopie (Oberflächenrauheit und Morphologie) . Alle Bilder in Tafel (c) haben den gleichen Maßstab. (d) Normalisierte adhärente Zelldichte von E. coli. Die Daten werden auf die durchschnittliche adhärente Zelldichte auf dem SiO2-Substrat normiert. (e,f) Adsorbierte Menge an (e) Lysozym und (f) Rinderserumalbumin, bestimmt durch Quarzkristall-Mikrowaagenmessungen. Angegeben ist die Anzahl der Beobachtungen (n). P-Werte (Vergleiche mit der Bedingung „0/100“) wurden mithilfe von einfaktoriellen ANOVA-Tests ermittelt. (g) Charakteristische ToF-SIMS-Signale von Cholesterin (m/z 369,3) und Stearylpalmitat (m/z 257,2) von Mehrkomponenten-SCLs als Funktion der Schichtzusammensetzung. Das Spülen der Proben mit Milli-Q-Wasser führt nicht zu signifikanten Veränderungen der erfassten Signale, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass sich die räumliche Anordnung von Cholesterin und Stearylpalmitat bei Kontakt mit polaren Flüssigkeiten ändert (d. h. eine Grenzflächenanreicherung von Cholesterin auf eingetauchten Mehrkomponenten-SCLs). aufgrund ihrer antibioadhäsiven Eigenschaften ausgeschlossen). In den Grafiken (ab, df) werden der Mittelwert + die Standardabweichung angezeigt. (h) Kontaktzeitabhängige Wechselwirkungskräfte (bestimmt durch AFM-basierte Kraftspektroskopie) zwischen einer hydrophoben kolloidalen Sonde (∅10 µm Silikatkügelchen, modifiziert mit hydrophobem Silan) und der Oberfläche von Mehrkomponenten-SCLs. Der Mittelwert und der ± Standardfehler des Mittelwerts sind in Grafik (h) dargestellt.

Quelldaten

(a–c) Dynamische Kontaktwinkelmessungen an Schichten kutikulärer Collembola-Lipide ((a) SCLs, (b) SAMs und (c) Mehrkomponenten-SCLs). Für jeden Probentyp werden der fortschreitende (θadv) und der zurückgehende (θrec) Kontaktwinkel angezeigt. Bei einigen Proben wird die starke Fixierung der dreiphasigen Kontaktlinie nach 20 s Ruhezeit (dh θrec liegt nahe bei 0°) zusätzlich durch einen Pfeil angezeigt. Obwohl Palmitinsäure und Stearinsäure ebenfalls amphiphil sind, wurde für SCLs dieser Verbindungen keine ruhezeitabhängige Abnahme des Rückzugskontaktwinkels beobachtet. Es ist davon auszugehen, dass die lineare Molekülstruktur der Fettsäuren (im Gegensatz zur sperrigen Steroidstruktur des Cholesterins) zu einer dichteren Packung der Moleküle im SCL führt, wodurch die Beweglichkeit der Moleküle eingeschränkt wird. In allen Diagrammen werden der Mittelwert + die Standardabweichung angezeigt. (d) Aufeinanderfolgende Kontaktwinkelmessungen an derselben Position auf einem Cholesterin-SCL, wobei die Messstelle zwischen zwei Messungen mit Stickstoff getrocknet wird. Es werden konsistente Ergebnisse erzielt (d. h. ein hydrophob fortschreitender Kontaktwinkel und kein Rückzugswinkel nach einer Ruhezeit von 20 Sekunden). Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gewonnen.

Quelldaten

Temperaturabhängige adsorbierte Mengen von (a) Rinderserumalbumin und (b) Fibrinogen, bestimmt durch Quarzkristall-Mikrowaagenmessungen. Für Cholesterin-SCLs wird eine ausgeprägte Temperaturabhängigkeit der Proteinadsorption beobachtet. Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gewonnen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen. (c) Die Temperaturabhängigkeit der freien Gibbs-Adsorptionsenergie wird aus der Menge an adsorbiertem Lysozym in Quarzkristall-Mikrowaagenmessungen abgeleitet (Abb. 3a). Datenpunkte wurden mit ΔG = –RT × ln(q/(c* – c*q)) berechnet, wobei R die universelle Gaskonstante, T die absolute Temperatur, q der adsorbierte Oberflächenanteil und c* die normalisierte Proteinkonzentration ist (c* = 6,8·10–6). Die Oberflächenanteile wurden als Verhältnis der experimentell bestimmten Menge zur maximalen Menge gesättigter Monoschichten adsorbierten Lysozyms berechnet (ausführliche Erläuterung siehe Ergänzende Anmerkung 2). Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardfehler, die aus den Proteinadsorptionsmessungen (mindestens drei unabhängige Experimente) abgeleitet wurden. Die Bestimmtheitsmaße (R2) für lineare Anpassungen der First-Principle-Bestimmung der Entropiebarriere ΔS (durch ΔG = ΔH – T ΔS) sind ebenfalls in der Abbildung angegeben.

(a) Das linke Feld zeigt die Simulationsbox für ein System mit vier Schichten Cholesterin oder Stigmasterin in Kontakt mit einer Wasserschicht und Vakuum darüber und darunter. Hydrophobe Wände lagen bei z = 0 und z = 50 nm. Das rechte Feld zeigt das Lipid-Mehrschicht-Wasser-System in der Simulationsbox. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind Salzionen innerhalb der Wasserschicht nicht dargestellt. Sauerstoffatome an der hydrophilen Hydroxylgruppe von Cholesterin oder Stigmasterol werden als Kugeln und hydrophobe Schwänze als blaue Stäbchen dargestellt. (b) Simulationsschnappschüsse bei 0 und 1 µs aus einer molekulardynamischen (MD)-Trajektorie für Cholesterin- und Stigmasterol-Mehrschichtsysteme in Kontakt mit Wasser mit Gleichgewichtszuständen (0 % gedrehte Moleküle) und absichtlich umgekehrter Molekülorientierung von 10, 30 und 50 % Moleküle in der Grenzschicht. Bei 0 µs wurden die Produktionssimulationen nach Durchführung mehrerer Äquilibrierungsschritte gestartet (Einzelheiten siehe Methoden und Ergänzende Anmerkung 4). (c) Visuelle Darstellung des Vektors, der die C3- und C17-Atome auf Cholesterin oder Stigmasterol verbindet. Dieser Vektor wird als Richtungsgeber für jedes Molekül in der Korrelationsanalyse und der Berechnung des Winkels der Moleküle an der Grenzflächenschicht (relativ zur z-Achse) verwendet. (d) Winkel zwischen dem Vektor, der die C3- und C17-Atome verbindet, und der z-Achse aus einer repräsentativen Simulationstrajektorie für Lipid-Mehrschichtsysteme mit 10, 30 und 50 % umgekehrten Molekülen. Cholesterin-Mehrspielersysteme zeigen eine spontane Neuorientierung innerhalb von 1 µs Simulationszeit, während bei Stigmasterol-Kontrollen keine Neuorientierung beobachtet wird. (e) Korrelationsfunktion (Cr) als Funktion des Abstands zu einem Referenzmolekül, aufgetragen für jeweils drei Simulationstrajektorien von Stigmasterol-Mehrschichtsystemen (ohne veränderte Orientierung der Moleküle an der Grenzfläche). Fehlerbalken an jedem Punkt stellen die Standardabweichung an diesem Punkt über die Zeitintervalle dar. (f) Das Histogramm des mittleren RMSD über drei Simulationstrajektorien der Z-Komponente der Position aller Sauerstoffatome an der Grenzflächenschicht im Zeitbereich von 0,5 bis 1 µs zeigt eine höhere Fluktuation der Grenzfläche für cholesterinhaltige Mehrschichtsysteme.

Quelldaten

(a) AFM-basierte Hochgeschwindigkeits-Kraftkartierung (Quantitative Imaging™, siehe Methoden) wurde angewendet, um die gleichzeitige Exposition von polaren (d. h. die Cholesterin-Hydroxylgruppe) und unpolaren (d. h. die Cholesterin-Kohlenwasserstoffkette) molekularen Resten am zu erkennen Fest-Flüssigkeits-Grenzfläche von Cholesterin-SCLs, eingetaucht in eine polare Flüssigkeit. Unter Verwendung polarer (durch Anwendung eines O2-Plasmas in einer Plasmakammer) oder unpolarer (Hexamethyldisilazan-Beschichtung) AFM-Spitzen (siehe (b)) wurden Wechselwirkungskräfte in einem Gittermuster an Cholesterin-SCLs und Thiocholesterin-SAMs (d. h. mit dem unpolaren Cholesterin-Kohlenwasserstoff) quantifiziert Kette dauerhaft freigelegt) und Thiocholensäure-SAMs (d. h. mit dauerhaft freiliegender polarer Cholesterin-Hydroxylgruppe). Die Größenverhältnisse zwischen einer AFM-Spitze und einem einzelnen Cholesterinmolekül sind schematisch dargestellt. Obwohl die AFM-Spitze sehr scharf ist (der typische Krümmungsradius der Spitze beträgt weniger als 10 nm), ist sie immer noch deutlich größer als ein einzelnes Cholesterinmolekül. Somit erfassen die einzelnen Kraft-Weg-Kurven die integrierten Wechselwirkungen mehrerer Cholesterinmoleküle. Kraft-Distanz-Kurven wurden mit einer hohen Frequenz (d. h. einige Millisekunden pro Kraft-Distanz-Kurve) erfasst, die ausreichend schneller ist als die gemessene Zeit für die hydrophobe Äquilibrierung (d. h. einige Sekunden, Abb. 2c), wodurch ein „Schnappschuss“ erfasst wird. der molekularen Oberflächenorientierung. (c) Für unpolare AFM-Spitzen wurden oberflächenabhängige Verteilungen der Wechselwirkungskräfte gefunden. Für Thiocholinsäure-SAMs wurden überwiegend niedrige Wechselwirkungskräfte festgestellt. Die wenigen höheren Kräfte können aus Wechselwirkungen der AFM-Spitze mit dem unpolaren Teil des Thiocholensäuremoleküls resultieren, der durch Verformung oder Defekte im SAM zugänglich werden kann. Aufgrund der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der unpolaren AFM-Spitze und dem freiliegenden unpolaren Kohlenwasserstoffschwanz des Thiocholesterinmoleküls wurden für Thiocholesterin-SAMs deutlich höhere Wechselwirkungskräfte festgestellt. Bei Cholesterin-SCLs wurde beobachtet, dass die Wechselwirkungskräfte den Bereich der für die beiden untersuchten SAMs gemessenen Kräfte abdecken, was die Hypothese stützt, dass sowohl polare als auch unpolare Reste auf eingetauchten Cholesterin-SCLs exponiert sind. (d) Bei polaren AFM-Spitzen wurden keine Unterschiede zwischen den getesteten Oberflächen festgestellt. Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gewonnen.

Quelldaten

(a) Die Wechselwirkungskräfte einer unpolaren AFM-Spitze (siehe Erweiterte Daten, Abb. 7b) mit Cholesterin-SCLs und Thiocholesterin-SAMs wurden wiederholt an einer einzelnen Stelle auf der Probenoberfläche quantifiziert. Um den Einfluss der AFM-Spitze auf die Dynamik der Grenzflächen-Cholesterinmoleküle zu minimieren, wurden die Messparameter so gewählt, dass zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen eine Pause von 20 s eingehalten wurde. Pro Position wurden 16 aufeinanderfolgende Kraft-Abstandsmessungen mit hoher räumlicher Wiederholbarkeit erhalten, um sicherzustellen, dass ein identischer Satz von Oberflächenmolekülen zur Wechselwirkung mit der AFM-Spitze beitrug. Mindestens sechs verschiedene Standorte pro Bedingung wurden auf drei unabhängigen Probenoberflächen analysiert. (b) Auftragung der absoluten Wechselwirkungskräfte für alle Messreihen. Auf der unteren bzw. oberen X-Achse sind die fortlaufende Anzahl der an einem Punkt gemessenen Kraft-Weg-Kurven und die verstrichene Zeit aufgetragen. Die einzelnen Messreihen wurden auf den Mittelwert jeder Reihe normiert. Die resultierenden Werte sind in (c) aufgetragen. (d) Die Verteilung der relativen Standardabweichungen, die aus den einzelnen Kurven in (c) ermittelt wurden. Der Mittelwert + die Standardabweichung werden angezeigt. (e) Durchschnittliche Steigungen der linearen Regressionen, die an die einzelnen in (c) dargestellten Messreihen angepasst wurden. Für eine systematische Veränderung der Wechselwirkungskräfte im Verlauf einer einzelnen Messreihe (d. h. der Aufnahme von 16 Kraft-Weg-Kurven an einer Stelle der Probe) gibt es nur marginale Hinweise, wobei eine Beeinflussung des Messvorgangs durch Verschleiß bzw Eine Kontamination der modifizierten AFM-Spitze oder der Probenoberfläche kann ausgeschlossen werden. Der Mittelwert ± Standardabweichung wird angezeigt. Angegeben ist die Anzahl der Beobachtungen (n). P-Werte wurden mithilfe ungepaarter t-Tests bestimmt.

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(a) Schichtdicke, (b) Oberflächenrauheit und (c) Morphologie von Cholesterinanalog-SCLs, bestimmt durch Ellipsometrie und Rasterkraftmikroskopie. Die Bilder der Kontaktmodus-Rasterkraftmikroskopie in (c) wurden zur Bestimmung der Oberflächenrauheit verwendet. Während alle SCLs eine relativ einheitliche Dicke von 150–200 nm haben, variieren ihre Morphologie und Rauheit. Ein signifikanter Einfluss der morphologischen Oberflächeneigenschaften auf die Bioadhäsionseigenschaften ist jedoch ausgeschlossen, da z. B. Cholesterin- und Dehydrocholesterin-SCLs eine stark divergierende Oberflächenrauheit, aber sehr ähnliche Bioadhäsionseigenschaften aufweisen (siehe Extended Data Abb. 10). (d) Dynamische Kontaktwinkelmessungen der Cholesterinanalog-SCLs. Für SCLs von nicht-amphiphilen Cholesterinanaloga gibt es nur eine von der Oberflächenrauheit abhängige Hysterese des Kontaktwinkels (d. h. je rauer die Oberfläche, desto höher die Hysterese aufgrund von Pinning-Effekten in Höhen der Oberfläche), aber keine ruhezeitabhängige Abnahme des Rückzugskontakts Winkel (d. h. eine dynamische Anpassung der Grenzflächenpolarität als Reaktion auf Änderungen der Polarität der Umgebung) wird beobachtet. Nur für Cholesterin- und Dehydrocholesterin-SCLs konnte eine kontaktzeitabhängige Abnahme des zurückweichenden Kontaktwinkels festgestellt werden. In allen Diagrammen werden der Mittelwert und die + Standardabweichung angezeigt. Angegeben ist die Anzahl der Beobachtungen (n).

Quelldaten

Normalisierte adhärente Zelldichte von (a) S. epidermidis und (b) E. coli auf Cholesterinanalog-SCLs. Die Daten werden auf die durchschnittliche adhärente Zelldichte auf dem SiO2-Substrat normiert. (c,d,e) Adsorbierte Menge an (c) Lysozym, (d) Rinderserumalbumin und (e) 10 % fötalem Rinderserum auf Cholesterinanalog-SCLs, bestimmt durch Quarzkristall-Mikrowaagenmessungen. In allen Diagrammen werden der Mittelwert + die Standardabweichung angezeigt. Angegeben ist die Anzahl der Beobachtungen (n). P-Werte (Vergleich mit dem Cholesterinzustand) wurden mithilfe von Einweg-ANOVA-Tests bestimmt.

Quelldaten

Diese Datei enthält ergänzende Abbildungen. 1–8, Tabellen 1–3, Anmerkungen 1–4 und Referenzen.

Dieser komprimierte Ordner enthält Quelldaten für ergänzende Abbildungen.

Videosequenz einer dynamischen Wasserkontaktwinkelmessung auf der Oberfläche einer Cholesterin-SCL. Der hohe fortschreitende Kontaktwinkel spiegelt eine hydrophobe Oberfläche wider. Nach sofortigem Rückzug des Tropfens (keine Ruhephase) wird ein leicht verringerter, aber immer noch hoher Rückzugskontaktwinkel beobachtet.

Videosequenz einer dynamischen Wasserkontaktwinkelmessung auf der Oberfläche einer Cholesterin-SCL. Der hohe fortschreitende Kontaktwinkel spiegelt eine hydrophobe Oberfläche wider. Bei Entnahme des Wassertropfens nach einer Ruhezeit von 20 s ist kein Rückzug der Drehstromkontaktlinie zu beobachten. Anschließend wird der Wassertropfen zurückgezogen. Während der 20-sekündigen Ruhezeit wurden Schwingungen in der dreiphasigen Kontaktlinie beobachtet.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Friedrichs, J., Helbig, R., Hilsenbeck, J. et al. Die entropische Abstoßung cholesterinhaltiger Schichten wirkt der Bioadhäsion entgegen. Natur 618, 733–739 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06033-4

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Eingegangen: 01. Februar 2021

Angenommen: 30. März 2023

Veröffentlicht: 21. Juni 2023

Ausgabedatum: 22. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06033-4

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